متانول و استونیتریل اسیدهای آلی هستند که معمولاً به عنوان فاز متحرک در کروماتوگرافی فاز معکوس استفاده می‌شوند. خواص این دو اسید آلی متفاوت است و در زیر 7 تفاوت کلیدی که هنگام استفاده از متانول یا استونیتریل برای تجزیه و تحلیل باید در نظر داشته باشید را شرح می‌دهیم.
قبل از شروع لازم به ذکر است، شرکت شهرشیمی به عنوان یکی از فروشندگان عمده استونیتریل، این محصول را در گرید صنعتی با کیفیت و قیمت رقابتی به فروش می‌رساند. جهت خرید این ماده با کارشناسان فروش ما در ارتباط باشید.
۱. فشار ستون
شکل ۱ نمونه‌ای از نسبت حلال و فشار تحویل حلال برای مخلوط‌های آب/استونیتریل و آب/متانول را نشان می‌دهد.
فشار نیز با کاهش ویسکوزیته حلال به دلیل دمای بالاتر ستون، تمایل به کاهش دارد. با تنظیم دمای ستون بین ۲۵ تا ۴۰ درجه سانتی‌گراد و مقایسه فشارهای ستون برای آب/استونیتریل و آب/متانول، می‌توانیم ببینیم که فشار برای متانول بیشتر است. هنگام تغییر فاز متحرک از استونیتریل به متانول، مقاومت فشاری تجهیزات و ستون باید دوباره بررسی شود.
۲. طیف جذب
شکل‌های ۲ و ۳ طیف‌های جذب استونیتریل و متانول را نشان می‌دهند، که شامل حلال‌های تجاری برای استفاده در HPLC و حلال‌های با کیفیت بالا می‌شود. حلال‌های آلی تجاری برای HPLC پردازش شده‌اند تا تقریباً تمام ناخالصی‌ها حذف شوند و جذب آنها در محدوده مشخصی بین طول موج‌های مشخص شده نمایش داده شود.
همانطور که در شکل ۲ مشاهده می‌شود، جذب استونیتریل گرید HPLC به ویژه در طول موج‌های کوتاه پایین است. بنابراین این استونیتریل گرید HPLC برای تجزیه و تحلیل با حساسیت بالا با تشخیص UV در ناحیه طول موج کوتاه مناسب است. علاوه بر این، حلال‌های آلی که برای تجزیه و تحلیل LCMS پردازش شده‌اند، هم ناخالصی‌های جاذب UV و هم فلزات باقی‌مانده از آنها حذف شده است.
این امر از ایجاد نویز پس‌زمینه خاص برای تجزیه و تحلیل LCMS جلوگیری می‌کند. هنگام تغییر حلال آلی از استونیتریل به متانول، ممکن است پیک‌های شبح در تجزیه و تحلیل گرادیان به دلیل شرایط تحلیلی در محدوده طول موج کوتاه UV شناسایی شوند.
در این صورت، توصیه می‌کنیم گرید حلال را دوباره بررسی کنید. اگر علت پیک‌های شبح مشخص نیست و مشکلاتی در نتایج تحلیلی ایجاد می‌کند، Ghost Trap DS را امتحان کنید که ناخالصی‌ها را از حلال‌های آلی حذف می‌کند.
۳. قدرت شستشو
شکل ۴ یک نمونه جداسازی پارابن‌ها، که اسید p-هیدروکسی بنزوئیک است، با ستون ODS را نشان می‌دهد. مشاهده می‌شود که وقتی استونیتریل و متانول با نسبت مساوی با آب مخلوط می‌شوند، فاز متحرک استونیتریل قدرت شستشوی بیشتری نشان می‌دهد.
نوموگرام در شکل ۵ نسبت‌های متانول و استونیتریل به آب با قدرت حلال معادل را نشان می‌دهد که برای محاسبه تقریبی قدرت شستشو هنگام تغییر بین این حلال‌ها مفید است. اگر قبلاً از استونیتریل به عنوان فاز متحرک با نسبت ۵۰/۵۰ (v/v) با آب استفاده می‌کردیم، هنگام تغییر به متانول، نسبت معادل متانول/آب ۶۰/۴۰ (v/v) خواهد بود.
۴. گزینش‌پذیری جداسازی
گزینش‌پذیری جداسازی استونیتریل و متانول متفاوت است، اما از آنجا که گزینش‌پذیری به خواص ترکیب حل‌شده بستگی دارد، اینطور نیست که گزینش‌پذیری همیشه برای یکی از این دو بیشتر باشد.
در جداسازی ایزومرهای موقعیتی، ستون‌های فنیل ممکن است مناسب‌ترین ستون‌ها در میان ستون‌ها برای کروماتوگرافی فاز معکوس باشند. علاوه بر برهم‌کنش‌های آبگریز، برهم‌کنش‌های π-π فاز ساکن فنیل به جداسازی کمک می‌کند.
شکل ۶ نمونه‌ای از جداسازی ایزومرهای موقعیتی کرزول را نشان می‌دهد. استونیتریل (CH3-C≡N) دارای پیوند سه‌گانه C-N و بنابراین الکترون‌های π است، در حالی که متانول (CH3-OH) فاقد الکترون‌های π است. برای یک ستون فنیل، استفاده از متانول به عنوان فاز متحرک اجازه برهم‌کنش‌های π-π را می‌دهد که جداسازی را بهبود می‌بخشد.
۵. رفتار بازداری
متانول و استونیتریل خواص شیمیایی متفاوتی دارند. متانول یک حلال پروتیک است، در حالی که استونیتریل یک حلال غیر پروتیک است، بنابراین می‌دانیم که رفتار شستشوی آنها متفاوت خواهد بود. اگر جداسازی کافی با یک فاز متحرک مبتنی بر استونیتریل به دست نیاید، تغییر به یک فاز متحرک مبتنی بر متانول برای تغییر ترتیب شستشو، یک احتمال مفید برای توسعه روش است.
شکل ۷ نمونه‌ای از جداسازی توسط متانول یا استونیتریل ترکیباتی را نشان می‌دهد که در آنها یک اتم هیدروژن از حلقه بنزن با یک گروه کربوکسیل یا یک گروه هیدروکسیل جایگزین شده است. هنگامی که سه ترکیب به طور مساوی بازداری می‌شوند، می‌توان دید که ترتیب شستشوی فنول و اسید بنزوئیک بسته به حلال مورد استفاده تغییر می‌کند.
بسته به نوع ستون، ممکن است علاوه بر گروه‌های عاملی اصلاح شده شیمیایی مانند گروه‌های ODS و گروه‌های C8 (اکتیل)، اثرات جانبی از گروه‌های عاملی قطبی از مواد بسته‌بندی نیز وجود داشته باشد. همچنین مواردی وجود دارد که حلال‌های آلی و اثرات جانبی از گروه‌های عاملی با هم تأثیر مثبتی دارند.
شکل‌های ۸ و ۹ جداسازی ۱۳ آنتی‌بیوتیک سفم را با استفاده از یک ستون فاز معکوس و به ترتیب استونیتریل یا متانول، با شرایط تحلیلی یکسان در هر دو مورد، نشان می‌دهند. بازداری و ترتیب شستشو بسته به اینکه از استونیتریل یا متانول استفاده شود، متفاوت است. همچنین می‌دانیم که ترتیب شستشو بسته به فاز ساکن متفاوت است.
 |
 |
به عنوان مثال، هنگام مقایسه ستون‌های ODS و C8، ستون C8 به طور کلی مقادیر بازداری2 کوچکتری خواهد داشت. با این حال، به دلیل گروه‌های عاملی قطبی از مواد بسته‌بندی، صرفاً اینطور نیست که بازداری همیشه کوچکتر باشد. رفتار بازداری نیز متفاوت است. از آنجا که رفتار بازداری تحت تأثیر این عوامل مختلف قرار می‌گیرد، لازم است ترکیبات مختلف فازهای متحرک و ساکن را برای بهینه‌سازی شرایط تجزیه و تحلیل امتحان کرد.
۶. رسوب از مخلوط شدن با بافر
در کروماتوگرافی فاز معکوس، از بافرها با فازهای متحرک مبتنی بر آب استفاده می‌شود. آنها با حلال‌های آلی برای استفاده مخلوط می‌شوند، اما بسته به نوع بافر و حلال‌های آلی، مقدار بیش از حد حلال‌های آلی ممکن است باعث رسوب نمک بافر شود. جداول ۱ و ۲ نشان می‌دهند که آیا رسوب برای مخلوط‌های بافرهای رایج با استونیتریل یا متانول به ترتیب رخ می‌دهد یا خیر.
مقادیر موجود در جدول نسبت (v/v) را نشان می‌دهد که در آن رسوب شروع به رخ دادن می‌کند. می‌توانیم ببینیم که برای برخی از بافرها هیچ رسوبی برای هیچ یک از حلال‌های آلی وجود ندارد، اما به طور کلی متانول رسوب کمتری ایجاد می‌کند.
 |
 |
- مقادیر نشان داده شده در جدول ممکن است بسته به شرایط آزمایشگاه متفاوت باشد. ** “〇” به معنای عدم رسوب است.
۷. گرمای واکنش از مخلوط شدن با آب
برای شستشوی ایزوکراتیک، آب و حلال آلی از قبل مخلوط شده در بطری ذخیره به عنوان فاز متحرک استفاده می‌شوند. هنگامی که با آب مخلوط می‌شود، متانول به صورت گرمازا واکنش می‌دهد. در مقابل، استونیتریل به صورت گرماگیر واکنش می‌دهد و بنابراین دمای مایع به زیر دمای اتاق می‌رود. با بازگشت تدریجی مخلوط استونیتریل به دمای اتاق، حباب‌ها تمایل به تشکیل در مایع دارند.
همچنین، اگر مخلوط قبل از بازگشت به دمای اتاق به عنوان فاز متحرک استفاده شود، زمان‌های بازداری سریع‌تر خواهند بود و فقط با نزدیک شدن مایع به دمای اتاق تثبیت می‌شوند. در همین حال، متانول هنگام مخلوط شدن با آب، گرما تولید می‌کند که اثر گاززدایی دارد. این بدان معناست که تهیه مخلوط آب و متانول به عنوان فاز متحرک نیاز به مراقبت کمتری نسبت به مورد استونیتریل دارد.
خلاصه
در بالا ۷ نکته کلیدی در انتخاب بین متانول و استونیتریل به عنوان حلال آلی در آنالیز HPLC را معرفی کردیم. از دیدگاه گردش کار تحلیلی، تفاوت‌هایی در فشار ستون، جذب UV و سازگاری بافر وجود دارد، و هنگامی که صحبت از جداسازی تحلیلی می‌شود، باید به قدرت شستشو، گزینش‌پذیری جداسازی و رفتار بازداری توجه شود. درک این تفاوت‌ها در خواص شیمیایی متانول و استونیتریل، همراه با ترکیبات مناسب ستون، خطر مشکلات در آنالیز HPLC را کاهش می‌دهد و کارایی توسعه روش را بهبود می‌بخشد.
منبع:
- https://www.shimadzu.com/an/service-support/technical-support/lib/methanol-acetonitrile.html